DMCA.com Protection Status

Công nghệ chỉnh sửa gen: Từ nguyên sơ đến thành tựu  quan tâm

Được đăng bởi: Ẩn danh

Cập nhật lúc 08:47 ngày 28/12/2017

Các tiến bộ trong thao tác gen đã góp phần làm đơn giản hóa việc chỉnh sửa gen.

Vào giữa những năm 1980, Oliver Smithies thuộc đại học Wisconsin-Madison, và Mario Capecchi, đại học Utah đã đồng thời sử dụng tái tổ hợp tương đồng (homologous recombination) - một quá trình liên quan đến phân tử nhằm sửa chữa những DNA bị sai hỏng - với mục đích thay đổi gen trong bộ gen trên các tế bào chuột được nuôi cấy. Kỹ thuật này liên quan tới việc chèn một bản sao có mang gen ở giữa hai trình tự tương đồng với trình tự ở phân tử DNA mẹ, sau đó nó sẽ hoán đổi gen mà nó mang với DNA.

Tuy nhiên, Capecchi và Smithies không thể làm thay đổi di truyền ở động vật sống, cho đến khi Martin Evans, Đại học Cardiff ở Anh Quốc, thiết lập một phương pháp để nuôi tế bào gốc từ phôi chuột (ESC). Bởi chỉ có ESC hoặc tế bào ung thư mới có thể được nuôi trong thời gian lâu dài và tạo ra đủ vật liệu di truyền để kiểm tra, xác nhận sự tái tổ hợp tương đồng có xảy ra hay không.

Năm 1987, Capecchi đã chèn trúng đích ở một gen hoang dại; đồng thời và Smithies cũng đã chỉnh sửa trúng đích một gen đột biến trên ESCs chuột. Trong một loạt các công bố, họ đã tiến hành chỉnh sửa gen trên chuột, đánh dấu lần đầu tiên tạo ra động vật được biến đổi gen. Nhờ đó, Smithies, Capecchi, và Evans đã được trao giải thưởng Nobel năm 2007 trong lĩnh vực sinh lý học - y học.

Nhưng quá trình này không hề dễ dàng, Thomas Doetschman, nhà sinh học phân tử tại Đại học Arizona, đồng thời là một nghiên cứu sinh sau tiến sĩ trong phòng thí nghiệm của Smithies cho biết từ khi nhóm bắt đầu phát triển công nghệ, để có được một bản sao về mặt vật lý của một gen mong muốn, thì đòi hỏi cần phải tạo ra một thư viện các bộ gen – Bộ gen chuột được chia nhỏ thành nhiều đoạn mang trong các thực khuẩn thể, nuôi trong E. coli trên đĩa petri. Doetschman cho biết, "Một khi bạn đã tạo ra thư viện gen của mình trên đĩa, nó sẽ rất có giá trị". Các nhà nghiên cứu lưu giữ các đĩa đó trong tủ đông trong nhiều năm và sử dụng mẫu dò để tìm ra vi khuẩn bị nhiễm với thực khuẩn thể mang gen đích. Sau đó, họ sẽ sàng lọc thư viện, nuôi dòng vi khuẩn thích hợp, phân lập gen, và dựng nên môt cấu trúc mang gen - được gọi là vector đích – vector này sẽ được chuyển vào tế bào gốc chuột bằng công nghệ lỗ điện - electroporation. Sau khi kiểm tra và xác nhận quá trình chuyển gen bằng phản ứng chuỗi trùng hợp (PCR) hoặc lai DNA (Southern blot), ESCs sẽ được tiêm vào phôi nang và chờ để chọn những con chuột con mang gen chuyển qua nhiều thế hệ và xác định xem các tế bào của nó có mang gen chỉnh sửa kia có được chèn hay không.

Phần lớn công việc thủ công nhàm chán này đã trở nên lỗi thời trong những năm cuối thập niên 1980 và đầu những năm 1990, bởi sự phát minh và tự động hóa của PCR cùng với việc giải trình tự hoàn toàn bộ gen của chuột. Do đó, quá trình chỉnh sửa gen này vẫn không đạt hiệu quả cao. Tái tổ hợp tương đồng diễn ra cần có quá trình tổng hợp hoặc sửa DNA trong tế bào chủ; chính điều này đã khiến cho kỹ thuật trên không chính xác và khó để điều khiển. Do đó, trong một triệu tế bào, chỉ có 1 -10 tế bào mang vetor và chứa DNA biến đổi ở vị trí chính xác.

Năm 1994, nhà sinh học phát triển, Maria Jasin và nhóm nghiên cứu tại Viện Sloan Kettering ở New York đã tìm ra một cách để tăng tỉ lệ tái tổ hợp tương đồng từ 10 đến vài ngàn lần. Điểm mấu chốt chính là sử dụng enzyme endonuclease để phá vỡ cấu trúc mạch đôi, thường enzyme này cắt ở vị trí của 4-8 cặp base chính xác, được gọi là vị trí cắt giới hạn. Nhằm nâng cao quá trình chỉnh sửa thông qua tái tổ hợp tương đồng, các vị trí cắt sẽ được chèn vào tế bào. Nhóm nghiên cứu của Jasin đã chèn những vị trí cắt giới hạn có sẵn vào các vị trí ngẫu nhiên trong bộ gen của nguyên bào sợi chuột và sử dụng enzyme endonuclease của nấm men để thúc đẩy sự tái tổ hợp tương đồng ở các vùng gen được chèn vị trí cắt tương đồng.

Tuy nhiên, để tạo ra các đứt gãy mạch đôi xung quanh một gen - để thay thế gen đó bằng bản sao khác – đòi hỏi các vị trí cắt giới hạn phải ở gần gen. Vào ba năm trước đó, Nikola Pavletich và Carl Pabo, Đại học Johns Hopkins, đã công bố công nghệ ngón tay kẽm - Zinc fingers, một ứng dụng tiềm năng, có thể nhìn thấy trong cấu trúc tinh thể của protein gắn trênDNA. Pavletich và Pabo đã nhận thấy mỗi domain của Zinc finger đều gắn với một trình tự đặc biệt gồm ba bazơ, và có thể luân phiên gắn trên trình tự đích của chuỗi DNA. Năm 2001, các nhà nghiên cứu đã thành công trong việc kết hợp protein zinc finger với một nuclease để tạo ra những vết cắt đích trong DNA trên trứng một loài ếch. Nhờ kết hợp kỹ thuật này với kết quả nghiên cứu của nhóm Jasin, các nhà nghiên cứu không chỉ có thể tạo ra các đứt gãy đôi mà còn có thể thực hiện cắt ở bất kì vị trí nào trong bộ gen.

Tiến bộ vượt bậc

Raj Chari, một nghiên cứu sinh sau tiến sĩ trong phòng thí nghiệm của George Church tại Đại học Harvard cho biết: công nghệ Zinc finger nucleases (ZFNs) dù vậy đã không được sử dụng phổ biến vì nó khá khó để tiến hành, đòi hỏi người thực hiện phải có kiến thức chuyên sâu về cấu trúc protein; đồng thời, phải qua nhiều lần thử nghiệm. “Điển hình, phải mất đến vài tháng chỉ để chuẩn bị hóa chất cho thí nghiệm”.

Vào năm 2011, phòng thí nghiệm của Gersbach đã tiến hành thực hiện dự án chỉnh sửa một loại đột biến trên gen dystrophin với công nghệ ZFNs, kéo dài tới hai năm nhưng vẫn chưa hoàn thành. Khi đó, một trong những sinh viên của ông đã đề nghị chuyển sang một công nghệ mới, sử dụng enzyme phân cắt acid nucleic giống nhân tố hoạt hóa phiên mã (Transcription activator-like effector nucleases – TALENs). Tuy nhiên, Gersbach đã cho rằng kĩ thuật đó không hề dễ dàng như ta thấy và tốt nhất là nên sử dụng ZFNs trong suốt dự án. Và do đó ông đã không đồng ý. Dù vậy, cậu sinh viên đó vẫn muốn thực hiện công nghệ TALENs. “Hai tháng sau, cậu sinh viên đó gặp tôi và nói cậu ấy đã hoàn thành toàn bộ công việc bởi việc sử dụng TALENs”, Gersbach nhớ lại.

Tương tự với zinc fingers, TALENs là các protein được gắn DNA, có khả năng gắn vào enzyme nuclease (tạo nên TALEN), nhưng mỗi đơn vị nhỏ TALEN chỉ gắn vào một bazơ đơn, do đó, chúng sẽ dễ dàng kết hợp với nhau để nhắm tới các trình tự chính xác. Gersbach cho biết, “TALENs đã làm được điều này trong khi hầu hết ZFNS không mang lại hiệu quả”.

Hai năm sau đó, khi kỹ thuật CRISPR/Cas9 được công bố, sinh viên của Gersbanch đã đề nghị chuyển sang sử dụng kỹ thuật này. Một lần nữa, ông đã từ chối. Tuy nhiên, ông ấy nói: “May mắn thay họ đã không nghe theo lời của tôi”. Nhờ đó, vào tháng 12 năm 2015, nhóm nghiên cứu của Gersbanch là một trong ba nhóm đã thành công trong việc sử dụng CRISPR/Cas9, chỉnh sửa gen dystrophin trên hai đối tượng, chuột sơ sinh và chuột trưởng thành.

Gần đây, công nghệ chỉnh sửa gen CRISPR/Cas được sử dụng rất phổ biến. Chỉ trong năm 2012, đã có tới 126 công bố trên Pubmed liên quan đến công nghệ này; gấp khoảng 10 lần so với số lượng công bố trong sáu tháng đầu năm nay. Khuynh hướng mới này đã đưa đến một cuộc tranh luận quốc tế về vấn đề đạo đức đối với việc chỉnh sửa gen người, và sự tranh cãi về vấn đề bản quyền giữa các đối thủ; đồng thời, các cộng sự cũng chứng minh tầm quan trọng của công nghệ chỉnh sửa gen đối với khoa học sự sống. Hơn hết, công nghệ này đã làm thay đổi cuộc chơi trong công nghệ chỉnh sửa gen, nó có thể chỉnh sửa DNA trong dòng tế bào, phôi và thậm chí ở chuột.

Doetschman cho biết, “Kế từ khi CRISPR xuất hiện, rõ ràng nó đã làm cho sự sống trở nên đơn giản hơn rất nhiều”. Ngày nay, khi muốn tạo một dòng chuột mang gen biến đổi, hầu hết họ chỉ cần tìm một RNA dẫn đường để nhắm trúng đích protein CRISPR tới gen mong muốn, chèn plasmid mã hóa RNA và một enzyme Cas nuclease trực tiếp vào trứng chuột đã thụ tinh, bỏ qua giai đoạn nuôi ESC trong phòng thí nghiệm. “Đơn giản vô cùng. Thật khó để tin rằng CRISPR lại hiệu quả như vậy”.

Công nghệ chỉnh sửa gen: Từ nguyên sơ đến thành tựu

Tài liệu tham khảo:

Amanda B. Keener, “Gene Editing: From Roots to Riches”, The scientist, October 1, 2016.

Lược dịch Lê Văn Trình - Võ Hồng Ngọc

Biên tập Biomedia Việt Nam