Phương pháp định lượng miễn dịch phóng xạ( RIA)
Phương pháp định lượng miễn dịch phóng xạ( RIA)
- Nguyên tắc:
Nguyên tắc chung của phương pháp định lượng miễn dịch phóng xạ là dựa trên sự gắn cạnh tranh giữa hormon tự nhiên (hormon trong máu cần định lượng) và hormon đánh dấu phóng xạ với kháng thể đặc hiệu. Mức độ gắn của hai loại hormon này với kháng thể tỷ lệ thuận với nồng độ ban đầu của chúng: Đo phức hợp hormon gắn đồng vị phóng xạ-kháng thể bằng máy đếm phóng xạ rồi dựa vào đường cong chuẩn ta có thể tính được lượng hormon có trong dịch cần định lượng.
- Các bước tiến hành
- Tạo kháng thể có tính đặc hiệu cao với hormon cần định lượng bằng cách tiêm hormon tinh khiết cho một số loài động vật (chuột, thỏ…).
- Trộn chung kháng thể với hai loại hormon:
Dịch chứa hormon cần định lượng
Hormon chuẩn tinh khiết có gắn đồng vị phóng xạ.
Điều kiện để thực hiện được phương pháp định lượng miễn dịch phóng xạ là lượng kháng thể phải không đủ để gắn hoàn toàn với cả hai loại hormon gắn phóng xạ và hormon cần định lượng. Khi đó, tình trạng gắn cạnh tranh giữa hormon có trong dịch cần định lượng và hormon chuẩn gắn phóng xạ với kháng thể sẽ xảy ra.
- Tách phức hợp hormon gắn với kháng thể ra khỏi phần dịch còn lại.
- Đo phức hợp hormon gắn phóng xạ kháng thể bằng máy đếm phóng xạ. Nếu lượng hormon phóng xạ gắn với kháng thể nhiều thì có nghĩa là phức hợp hormon cần định lượng gắn với kháng thể ít hay nói cách khác nồng độ hormon trong dịch cần định lượng thấp.
- Trong quá trình làm 4 bước trên, song song với việc tiến hành trên mẫu dịch cần định lượng, người ta cũng tiến hành các bước tương tự như trên với những mẫu hormon chuẩn đã biết trước nồng độ. Sau khi thực hiện với nhiều nồng độ khác nhau ta vẽ được đường cong chuẩn.
- Tính lượng hormon có trong mẫu dịch cần định lượng bằng cách so sánh lượng phức hợp hormon phóng xạ gắn kháng thể đếm được từ mẫu chưa biết với đường cong chuẩn vẽ được từ mẫu đã biết trước (Hình 7.7)
Bằng cách này, ta có thể tính được nồng độ hormon trong mẫu cần định lượng với độ nhạy có thể phát hiện được với lượng picogam. Sai số của phương pháp này vào khoảng 10-15% so với giá trị thực.
Một số hormon như cortisol hay aldosteron cũng được định lượng theo phương pháp miễn dịch phóng xạ nhưng người ta thường sử dụng các globulin huyết tương là những chất thường gắn đặc hiệu với các hormon này trong máu để thay thế cho các kháng thể đặc hiệu trong quá trình định lượng. Các bước tiến hành được thực hiện hoàn toàn theo phương pháp RIA.
Theo nguyên lý đã được trình bày ở trên, hiện nay người ta đã sản xuất ra các kít RIA thương phẩm do vậy đã làm đơn giản hóa các bước thực hiện.
Bằng phương pháp miễn dịch phóng xạ, người ta có thể định lượng hàng trăm mẫu cùng một lúc và cho kết quả nhanh, chính xác.
Hình 7-7. Đường cong chuẩn để định lượng aldosteron bằng RIA