Nghiên cứu các chất ức chế protease của HIV nhằm phát triển thuốc điều trị AIDS

Việt Nam với nguồn thực vật phong phú và nhiều cây thuốc, vị thuốc có giá trị đối với sức khỏe con người. Hiệu quả chữa bệnh của dược liệu Việt Nam đã được chứng minh qua hàng nghìn năm. Các nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng các cây thuốc Việt Nam có chứa nhiều hoạt chất có tác dụng sinh học đáng chú ý. Vì vật thực vật Việt Nam cũng là nguồn nguyên liệu phương pháp để sàng lọc và xác định các hoạt chất ức chế protease HIV-1, làm cơ sở cho việc phát triển thuốc điều trị cho bệnh nhân HIV/AIDS. Tuy nhiên, cho đến nay chúng ta chưa khai thác nguồn tài nguyên phong phú của đất nước theo hướng này.

Trước thực tế cần sớm có chế phẩm protease của HIV-1 tái tổ hợp có hoạt tính, chất lượng cao cũng như tìm ra một số chất ức chế protease của HIV-1 có nguồn gốc từ dược liệu Việt Nam, nhóm nghiên cứu do PGS.TS. Bùi Phương Thuận, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội đứng đầu đã tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu các chất ức chế protease của HIV nhằm phát triển thuốc điều trị AIDS” nhằm có thể sản xuất và sử dụng protease tái tổ hợp của HIV-1 để sàng lọc các hoạt chất ức chế enzyme này từ thảo dược Việt Nam. 

Qua 36 tháng triển khai nghiên cứu (12/2012- 12/2015), nhóm nghiên cứu đã thu được các kết quả như sau:

- Đã xây dựng được quy trình biểu hiện gen mã hóa protease của HIV-1 phân lập tại Việt Nam: gen mã hóa cho protease của HIV-1 phân lập tại Việt Nam được thiết kế và biểu hiện trong 11 dạng cấu trúc protease với đầu N, C khác nhau ở vi khuẩn E.coli và nấm men P. pastpris. Protease HIV-1 không tan biểu hiện chủ yéu trong phân đoạn tủa của tế bào BL21 (DE3) RIL, enzym hồi tình có hoạt tính phân giải cơ chất đặc hiệu. Điều kiện nuôi cấy tế bào BL21 (DE3) RIL thích hợp cho biểu hiện protease của HIV-1 là tại 37 độ C trong môi trường LB không có glucose sau 4giờ với nồng độ cảm ứng của IPTG 0,5mM tại pha giữa quá trình sinh trưởng của tế bào.

- Đã tinh sạch protease có hoạt tính của HIV-1sử dụng hệ thống biểu hiện đã được tối ưu hóa: Quá trình tinh sạch này gồm các bước: (1) rửa tủa tế bào; (2) sắc ký qua cột mono Q-sepharose và cột Ni-sepharose mắc nối tính, rửa chiết enzym bám trên cột Ni-sepharose bằng đệm C (Tris-HCl 20mM, pH 7,9 NaCl 100mM, urea 8M, imidazol 5 mM) có chứa imidazol 250mM; (3) hồi tính protease HIV-1 bằng thẩm tích trong đệm D (Tris-HCl 20mM, pH 7,9, NaCl 50mM, DTT 1mM, β-ME 1mM, glycerol 10%) với nồng độ urea giảm dần.

- Tìm ra được một số hằng số động học của protease HIV-1: protease HIV-1 thủy phân cơ chất huỳnh quang đặc hiệu theo kit Anaspec với Km = 11,86µM, Vmax = 0,22µM/phút và hoạt độ riêng 33,06 pmol/phút/µg.

- Nghiên cứu xác định được cấu trúc phân tử của protease HIV-1: protease HIV-1 tái tổ hợp dạng hồi tính có dimer chiếm 15 -25% bằng điện di bán biến tính trên SDS-PAGE. Cấu trúc bậc 1 của protease HIV-1 gồm 114 gốc axit amin, KLPT gần 12,8kDA với trình tự giống 100% với trình tự axit amin theo tính toán lý thuyết. Ở mức độ cấu trúc bậc 2, protease HIV-1 có dạng phiến gấp nếp β rõ tệt chiếm khoảng 28%, phổ CD tương tự các protease HIV-1 đã công bố. Theo mô hình cấu trúc 3D, protease HIV-1 là một homodimer gồm 2 monomer với dạng chủ yếu là phiến gấp nếp β. Kết quả này phù hợp với kết quả phân tích cấu trúc bậc 2 bằng phương pháp CD và các cấu trúc protease HIV-1 khác đã được công bố trên ngân hàng protein PDB.

- Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho sản phẩm protease HIV-1 tái tổ hợp: chế phẩm protease HIV-1 có độ sạch trên 98%. Chế phẩm nên bảo quản ở dạng dung dịch, vẫn còn nguyên 100% hoạt tính sau 4 giờ bảo quản tại 4 độ C, sau 3 tháng bảo quản tại - 80 độ C.

- Đã xây dựng được quy trình sản xuất protease HIV-1 ở quy mô phòng thí nghiệm

- Sàng lọc được các cây thuốc có tác dụng ức chế protease của HIV-1 và xác định hoạt chất có khả năng ức chế protease: Đã sàng lọc được 48/156 mẫu thực vật và 1/48 hợp chất thực vật thứ sinh sẵn có, có khả năng ức chế pepsin. Khoanh vùng được 5 mẫu thực vật và lựa chọn được 3 mẫu thực vật có tiềm năng ức chế protease HIV-1 cao nhất là: lá cây Gối hạc (Leea rubra Blume.), cây Ổi (psidium guajava L.) và cây Hồng (Diospyros kaki T.).

- Xây dựng quy tình tinh sạch và xác định cấu trúc ức chế từ các dịch chiết thực vật.

- Nghiên cứu một số tính chất của các hoạt chất tác chiết từ thảo dược Việt Nam: 03 hoạt chất axit maslinic, axit ursolic và axit 24-hydroxy ursolic đã ức chế đặc hiệu protease HIV-1 với giá trị IC50 thấp hơn từ 300 - 1000 lần so với pepsin-enzym thuộc cùng nhóm protease aspartyl và mang những đặc điểm tương đồng cao với protease HIV-1, thường được dùng như một enzym đích để sàng lọc các chất ức chế protease HIV-1. 03 hoạt chất này đã ức chế protease HIV-1 theo kiểu không cạnh tranh, khi có mặt của 03 hoạt chất ở các nồng độ khác nhau, các giá trị Km, Vmax đều giảm so với khi không có mặt của chất nghiên cứu. Kết quả kiểm tra độc tính của 03 hoạt chất trên mô hình chuột nhắt trắng cho thấy, ngay sau khi uống mẫu thử axit maslinic, cũng như axit ursolic ở cả hai liều là 2,0g.kg và 4,0g/kg thể trọng chuột thí nghiệm, tất cả các con chuột đều không có biểu hiện bất thường nào. Sau 72 giờ theo dõi, tất cả các lô chuột uống axit maslinic cũng như lô chuột uống axit  ursilic đều hoạt động và ăn uống bình thường. Đối với axit  24-hydroxyursolic với hai liều 2,0g.kg và 4,0g/kg thể trọng, số lượng chuột chết lần lượt là 07 và 03 con. Tuy nhiên, khi giảm xuống liều 1,0g/kg thể trọng tất cả các con chuột đều không có biểu hiện bất thường nào. Sau 72 giờ theo dõi, tất cả chuột đều hoạt động và ăn uống bình thường. Như vậy trong 03 hoạt tính, mức độ độc tính giảm dần theo thứ tự axit 24-hydroxyursolic, axit ursolic và axit maslinic.

- Xây dựng một số tiêu chuẩn cơ sở cho sản phẩm hoạt chất ức chế protease HIV-1 tách chiết từ thảo dược Việt Nam: nhóm nghiên cứu đã đánh giá được một số tiêu chuẩn cho 03 hoạt chất (axit  24-hydroxyursolic, axit ursolic và axit maslinic): độ tinh sạch trên 95%, khả năng ức chế protease HIV-1 với các giá trị IC50 tương ứng là 3,0 ± 0,8µM; 3,5 ± 0,9µM và 7,5 ± 1,5µM tương đương với 02 chế phẩm axit ursolic và axit maslinic thương mại của hãng Sigma Aldrich; dạng bảo quản phù hợp cho 03 hoạt chất là dạng bột, hòa tan trong DMSO trước khi thử hoạt tính In vitro.

- Xác lập được quy trình sàng lọc, tách và tinh sạch các hoạt chất ức chế protease của HIV-1 từ thảo dược Việt Nam ở quy mô phòng thí nghiệm. Các quy tình này đạt được các yêu cầu về hiệu suất kinh tế, ít độc hại với môi trường. Từ quy trình này, nhóm nghiên cứu thu nhận được hơn 50mg tương ứng các hoạt chất axit 24-hydroxyursolic, với độ sạch trên 98% trên HPLC. 03 hoạt chất đã ức chế mạnh hoạt tính thủy phân cơ chất đặc hiệu của protease HIV-1.

Các kết quả nghiên cứu cứu trên đã được công bố trên tạp chí Sinh học và Tạp chí Khoa học và Công nghệ. Nhóm nghiên cứu cũng đã được Cục SHTT chấp nhận đơn xin đăng ký 01 giải pháp hữu ích cho Quy trình chiết hợp chất axit ursolic và axit maslinic có hoạt tính ức chế enzym proteaza HIV-1 từ lá Ổi.

Từ khóa dược liệu HIV/AIDS cây ổi cây gối hạc cây hồng

Nguồn: most.gov.vn