Công cụ nghiên cứu các RNA không mã hóa

Các RNA thông tin được cho là công cụ thiết yếu trong dịch mã, điều hòa biểu hiện gen ở tế bào. Các RNA không mã hóa (non-coding RNAs (ncRNAs)) bao gồm micro RNAs (miRNAs), RNAs không mã hóa lớn (long non-coding RNAs-(lncRNAs)) cũng quan trọng  không kém, thu hút sự chú ý của các nhà khoa học. RNA không mã hóa được coi là một loại chỉ thị sinh học phát hiện các bệnh nguy hiểm như ung thư, tự kỷ, Alzheimer và nhiều bệnh khác. Theo các nhà nghiên cứu và các nhà lâm sàng việc tìm cách phát hiện ncRNA trong dịch sinh thiết không xâm lấn như máu (chứ không phải các mẫu mô sinh thiết có xâm lấn) sẽ phát triển các phương pháp giúp chẩn đoán và chữa trị tốt hơn. Trong bài báo này chúng tôi sẽ đề cập đến một số lợi thế của ncRNA và các ứng dụng của nó trong nghiên cứu và điều trị.

Tách chiết các dạng ncRNA

Thông thường các nhà nghiên cứu tách chiết ncRNA thông qua việc tách chiết các RNA tổng số (bao gồm cả RNA mã hóa và RNA không mã hóa), sau đó thu ncRNA quan tâm bằng cách thiết kế mồi và khuếch đại. Để quá trình tách chiết trở nên đơn giản, các kit tách RNA được sử dụng thường quy. Hiện nay, trên thị trường có rất nhiều hãng cung cấp các kit tách RNA tổng số, trong đó có QIAGEN. Hãng này cung cấp nhiều loại kit khác nhau dựa trên kích thước của loại RNA cần thu nhận. Cụ thể, kit RNeasy dùng để tách chiết RNA tổng số có kích thước từ khoảng 100 nucleotide (nt) trở lên, kit miRNeasy dùng để tách RNA tổng số có chiều dài từ 18 nucleotid trở lên. Có nhiều hãng khác cung cấp kit tách RNA tổng số như: Bio-Rad Laboratories, Clontech, Epicentre (an Illumina company), MilliporeSigma, Norgen Biotek, Promega, Thermo Fisher Scientific và Zymo Research.

Hãng Amid lại tỏ ra hứng thú khi dùng miRNA phân tách được từ các sinh phẩm dạng lỏng như các chỉ thị sinh học. QIAGEN tập trung nghiên cứu, phát triển các dung dịch thích hợp trong tách chiết RNA từ các loại mẫu sinh thiết dạng lỏng. Một loại kit thuộc nhóm miRNeasy kit là exoRNeasy, kit này tập trung vào mục đích tinh sạch và làm giàu các exsome sau đó mới tách RNA tổng số (theo công bố của Brian Dugan, quản lý sản xuất của miRNA tại QIAGEN). Công ty cũng sản xuất các loại kit miRNA plasmid/ huyết thanh. Dugan cũng khẳng định: “Chúng tôi nghiên cứu cải tiến các dung dịch nhằm phân tích các miRNA trong mẫu máu và các sinh phẩm (dạng lỏng) khác do có nhiều nhà nghiên cứu thực sự mong muốn điều đó”. Thêm nữa, gần đây QIAGEN vừa công bố kit giải trình tự RNA đích giúp đọc trình tự các lncRNA (và cả mRNA) dễ dàng.

Tách chiết ncRNA là việc rất hữu ích đối với các nhà nghiên cứu lâm sàng về ung thư. Jeffrey Franz (quản lý chính phụ trách việc chuẩn bị mẫu thuộc công ty Thermo Fisher Scientific) và các nhà khoa học khác đang cố gắng “đưa ra phác đồ điều trị cho các bệnh nhân thông qua chỉ thị sinh học, từ đó lựa chọn các dược phẩm phù hợp với từng bệnh nhân. Hơn nữa, để kiểm tra các đột biến liên quan đến ung thư, các nhà nghiên cứu đang nỗ lực kiểm tra RNA để có các thông tin giúp định hướng cho giai đoạn 2 trong điều trị, đó là sử dụng thuốc”. Tuy nhiên, các nhà nghiên cứu đều mong chờ các liệu pháp điều trị mới đồng thời yêu cầu các công cụ nghiên cứu RNA ở mức độ cao hơn. 

Các công cụ ncRNA mới

Nhiều kit tách RNA tổng số sử dụng cột để tinh sạch và thu mẫu; tuy nhiên, mẫu qua cột có thể chỉ áp dụng đối với số lượng mẫu ít, khó thực hiện khi lượng mẫu quá lớn. Công cụ mới giúp thực hiện cùng lúc nhiều mẫu sử dụng các hạt nam châm được cung cấp bới hãng Thermo Fisher’s MagMAX™ mirVana™ Total RNA Isolation Kit. Các phân tích được tiến hành liên tục hoặc có thể chạy tự động đối với các đĩa nuôi cấy, có đĩa lên tới 96 giếng (điều đó có nghĩa là có thể tiến hành phân tích cùng lúc 96 mẫu).

Các loại tế bào hiếm thu nhận từ hệ miễn dịch thường là các nghiên cứu mục tiêu của nhiều nhà khoa học.

Phó giáo sư Brian Brown tại viện nghiên cứu ung thư Tisch, trường đại học Icahn, Mount Sinai, thành viên của dự án miễn hệ gen miễn dịch (Immgen) được tài trợ bởi Viện nghiên cứu sức khỏe quốc gia Hoa Kỳ cho rằng: “Một trong những mục tiêu quan trọng của Immgen là xác định vai trò điều hòa của microRNA trong hệ miễn dịch chung và đưa kết quả nghiên cứu này đến các nhà khoa học. Thành công của nhóm nghiên cứu sẽ bao gồm việc tìm ra các tế bào miễn dịch hiếm gặp như tế bào NKT và các tế bào T delta gamma. Đây là những loại tế bào rất hiếm, chúng ta chỉ phân lập được chưa đến 10 000 tế bào”.

Brown sử dụng miScript platform của QIAGEN để thu miRNA do hệ thống này phù hợp đối với các mẫu có độ dư thấp. Ông cũng dùng miScript PCR array để thu hàng trăm miRNA. Hơn nữa, các loại kit khác của QIAGEN cũng rất hữu ích do chúng đã được chứng minh về chất lượng và độ phù hợp. Brown nhận định: “miScript platform là hệ thống chính được sử dụng trong quá trình nghiên cứu của chúng tôi do nó có thể đảm nhiệm công việc thu toàn bộ miRNA hệ gen từ các tế bào (ít hơn 10.000 tế bào)”.

Các công cụ ncRNA khác như RNA immunoprecipitation (RIP) assays của MilliporeSigma lại giúp tách các ncRNA ra khỏi hỗn hợp chứa đồng thời các thành phần khác như miRNA và các mRNA đích. Kit Magna Nuclear RIP™ của MilliporeSigma hỗ trợ các nhà nghiên cứu phân tích các RNA khác như lncRNA hay miRNA liên kết với chất nhiễm sắc. Kit magna ChIRP phân lập chất nhiễm sắc bằng tinh sạch RNA (ChIRP) có thể phân lập các loại lncRNA phục vụ nghiên cứu các chức năng điều khiển trong nghiên cứu bệnh học.

Christian Nievera, quản lý sản xuất sản phẩm platform phân tử ở MilliporeSigma nhận định rằng: hiện nay các nhà khoa học đang sử dụng các sản phẩm của công ty trong việc nghiên cứu mối liên quan giữa ncRNA và điều hòa bệnh học. Một ví dụ điển hình cho miRNA là let-7. Let-7 đóng vai trò quan trọng trong điều khiển sự biểu hiện gen DICER và c-MYC và liệu pháp điều trị trúng đích đối với ung thư và các bệnh về tim mạch. Phân tích ChIRP được sử dụng để nghiên cứu các lncRNA và ảnh hưởng của nó đối với hiệu quả điều hòa gen bao gồm làm cách nào lncRNA THRIL điều hòa sự hiểu hiện TNFα”.

Để bước chuẩn bị mẫu đơn giản hơn

Franz nhận định: Hiện nay, cước chuẩn bị mẫu để tách chiết RNA đã trở nên đơn giản hơn rất nhiều. Ví dụ, Thermo Fisher Scientific’s Cells-to-CT assay đã gộp các bước lysis tế bào, khuếch đại gen đích và phiên mã ngược trong một bước. Như vậy, các công ty dược và các phòng thí nghiệm được hỗ trợ khá nhiều trong khâu sàng lọc. Người dùng không cần thiết phải tách riêng ncRNA ngay từ bước đầu, các phân tích sẽ hướng tới quá trình khuếch đại trực tiếp đoạn gen cần nghiên cứu.
 
Abcam’s Firefly Multiplex miRNA assay platform giúp phát hiện miRNA trong máu, huyết tương và các mẫu huyết thanh mà không cần phân tách hay tinh sạch trước. 

Dan Pregibon, giám đốc điều hành chịu trách nhiệm cải tiến planform của Abcam đã nhận định: "Chúng tôi có thể thu miRNA trực tiếp từ mẫu sinh phẩm do kit của chúng tôi có sử dụng cơ chất gắn sinh học (bio-insert substrate), loại có chất không kết hợp với các protein hay các lipit có mặt trong mẫu sinh phẩm". Hệ thống phát hiện miRNA sử dụng gel rod, mỗi gel có một mã vạch riêng, liên kết với các vùng chỉ thị sinh học quan tâm. Rod đa năng được trộn với nhau để phát hiện nhiều mẫu cùng lúc. Bước tiếp theo của quá trình này là đọc kết quả bằng phân tích/ đo đạc tế bào theo dòng chảy (Flow cytometer). Các bước được thực hiện trên đĩa 96 giếng, chúng có thể phát hiện được tới 68 miRNA trong 1 mẫu. Các nhà nghiên cứu có thể phát triển sản phẩm để phát hiện ra cùng lúc 68 miRNA, tuy nhiên Abcam lại hướng tới mục tiêu phát hiện các miRNA theo từng nhóm cụ thể như nhóm gây ung thư, nhóm miễn dịch, nhóm có độc tính.

Pregibon và các cộng sự đang làm việc tại Abcam đang nghiên cứu phát triển các dấu hiệu chỉ thị sinh học (Biomarker signature) sử dụng công nghệ Firefly. Phức hệ này với các chỉ thị sinh học sớm có thể phát hiện 10 đến 50 miRNA dùng để sàng lọc các mẫu dùng trong phát hiện bệnh, Jordan Plieskatt, một nhà nghiên cứu làm việc tại phòng thí nghiệm của Jeffrey Bethony tại đại học Washington George cũng đã sử dụng Firefly platform để cải tiến các dấu hiệu chỉ thị sinh học đối với cholangiocarcinoma (CCA), một loại ung thư gan rất khó phát hiện. Ông hi vọng rằng chỉ thị sinh học CCA có thể hỗ trợ trong chẩn đoán hoặc chẩn đoán sớm ung thư và các bác sỹ cũng có nhiều thời gian hơn trong việc quyết định các liệu pháp can thiệp.

Một trong các tác nhân nguy hiểm CCA là phá hủy gan, ví dụ, đối với virus hepatitis hoặc trong dự án của Plieskatt đã phát hiện ra rằng sán lá gan Opisthorchis viverrini có mặt trong các bệnh nhân ở đông nam Á. Plieskatt đã nghiên cứu sự phân bố bệnh nhân CCA ở các vùng nông thôn Thái Lan, nơi các loại sán lá gan tồn tại rất phổ biến. Ông nhận thấy Firefly platform hoàn toàn đáp ứng được những gì ông mong muốn do kit có thể sử dụng với các thể tích mẫu nhỏ (từ 30-50µl huyết thanh hoặc huyết tương). Ưu điểm này giúp ông tiết kiệm được các mẫu bệnh phẩm thu được (mặc dù bộ kit này có thể phân tích được thể tích mẫu nhỏ hơn, khoảng từ 10 đến 20 µl). Ông còn mong muốn phát triển bộ kit có thể dung được ngay không qua khâu chuẩn bị mẫu. Plieskatt cũng hướng tới việc sử dụng kit ngay tại hiện trường, có thể áp dụng rộng rãi cho nhiều đối tượng khác nữa.

Nhóm nghiên cứu của Abcam cũng đã làm việc với Pliekatt với mong muốn áp dụng công nghệ Firefly vào hệ thống các thanh thu thập mẫu, trên đó ông đánh dấu các mẫu huyết thanh và huyết tương (giống như các thẻ sử dụng trong kiểm tra sàng lọc máu ở trẻ sơ sinh). Để thực hiện phân tích này ông đã cài các đĩa 7-mm ngoài các mẫu cần phân tích rồi đưa vào kit Firefly trong đó dung dịch đệm được thay thế bằng các mẫu máu khô.  Ông tự hào nói rằng: "Từ nay tôi đã có thể thu thập mẫu ngoài hiện trường không cần bảo quản lạnh vì miRNA bền khi chúng được cố định trên các thanh thu mẫu ở nhiều điều kiện nhiệt độ". Trong tương lai, thay vì mang mẫu từ nhà đến Massachusetts để phân tích, ông hi vọng có thể tiến hành phân tích ngay tại chỗ bằng cách sử dụng cytometer ở một số bệnh viện địa phương ở Thái Lan. Ngoài ra máu khô Firefly platform còn được sử dụng để thu các loại miRNA ở nhiều loại mẫu khác nhau, bao gồm máu chứa chất chống đông (heparin plasma) và mô gắn paraffin đã cố định formalin (formalin-fixed paraffin-embedded –FFPE).

Pliekatt chỉ góp ý bổ sung thêm phép đo màu vào các hạt hydrogel đối với một vài miRNA quan trọng, cách này có thể đọc kết quả ngay lập tức. Đây cũng là cách giúp thực hiện các thử nghiệm ngay tại hiện trường trước khi tiến hành các nghiên cứu sâu hơn.

Firefly của Abcam cũng có thể kết hợp với nhiều miRNA và các chỉ thị sinh học protein sử dụng song song với các thanh đánh dấu chỉ thị sinh học trong các phân tích miRNA và các phân tích miễn dịch mới. Pregibon đã rất hứng thú với hướng phát hiện cùng lúc miRNA với các protein dạng các đánh dấu chỉ thị sinh học. “Chúng tôi đã nói với khách hàng, những người mong muốn cả 2 phương pháp phân tích sàng lọc nhằm giám sát các liệu pháp miễn dịch ung thư, định lượng cả miRNA lẫn các cytokine liên quan đến đáp ứng miễn dịch”.

Ngày nay, do kiến thức của con người có sự tiến bộ rõ rệt, chúng ta đã hiểu được nhiều về các loại bệnh và nguyên nhân gây bệnh, như hệ miễn dịch hoạt động như thế nào và các loại ung thư đan xen nhau ra sao. Do đó, hiện nay các nhà khoa học hướng tới sử dụng công cụ RNA và ứng dụng nó cùng với công nghệ proteomics nhằm tìm ra sự đa dạng của các ncRNA.

Tài liệu tham khảo:

Caitlin Smith, "Tools for Non-coding RNAs", Biocompare, July 26, 2016.

Lược dịch Đỗ Thị Roan