Nghiên cứu chế tạo que thử phát hiện nhanh độc tố Staphylococcal enterotoxin B (SEB) của tụ cầu vàng

Ngộ độc thực phẩm là hiện tượng đau bụng, nôn mửa, nóng sốt, tiêu chảy… của người do ăn phải thức ăn không đảm bảo vệ sinh hoặc bị hư hỏng. Có nhiều nguyên nhân dẫn đến thực phẩm không an toàn, nhiễm vi khuẩn là một trong những nguyên nhân phổ biến gây bệnh trên toàn cầu. Tụ cầu vàng (Staphylococcus aureus - S. aureus) là một trong những nguyên nhân chính gây ngộ độc thực phẩm do chúng tiết ra các độc tố ruột Staphylococcal enterotoxins (SEs).

Độc tố của tụ cầu vàng được xếp vào họ những siêu kháng nguyên, chúng có tính ổn định cao, kháng với hầu hết các enzym phân hủy protein và vì thế chúng giữ được hoạt tính trong đường tiêu hóa sau khi được ăn vào bụng. Chúng còn kháng với chymotrypsine, rennin và papain. Đặc biệt, tính bền nhiệt là một trong những tính chất quan trọng nhất của các SE trong lĩnh vực an toàn thực phẩm. Chúng không bị phân hủy ở 100oC trong 30 phút, thậm chí ở 121oC trong 28 phút, các SE vẫn giữ được hoạt  tính sinh học. Tính kháng nhiệt của SE trong thực phẩm cao hơn so với trong môi trường nuôi cấy.

Tụ cầu vàng sản sinh được hơn 20 loại độc tố khác nhau từ SEA đến SEE, từ SEG đến SER và SEU. Trong các nhóm độc tố (siêu kháng nguyên) do S. aureus sản sinh kể trên thì độc tố ruột nhóm B (Staphylococcal enterotoxin B - SEB) là một độc tố mạnh, bền với nhiệt và hòa tan trong nước, chúng có phổ phân bố rộng rãi và là nguyên nhân gây nhiễm trùng nhiễm độc thực phẩm thường gặp nhất. Nguy hiểm hơn, SEB còn là một trong những nhóm độc tố được sử dụng làm vũ khí sinh học dùng để tấn công trong khủng bố sinh học và chiến tranh sinh học. Vì thế việc xác định sự có mặt của SEB nhằm đánh giá nguy cơ ngộ độc là vô cùng quan trọng. Hiện nay, một số hãng trên thế giới đã sản xuất que thử phát hiện trực tiếp độc tố SEB như: hãng Tetracore, hãng Advnt, hãng Alexeter… Tuy nhiên, các que thử này giá thành cao, không phù hợp với điều kiện kinh tế Việt Nam; kháng nguyên trong nước có thể biến đổi không phù hợp với que thử nhập ngoại và nếu nhập que thử nhanh, chúng ta sẽ không chủ động được nguồn khi cần thiết. Do đó, việc nghiên cứu tạo ra kháng nguyên tái tổ hợp không những loại bỏ được độc tố mà còn giữ nguyên được đặc tính miễn dịch như kháng nguyên dại để gây miễn dịch sản xuất kháng thể đơn dòng, đa dòng kháng SEB là cần thiết và đây là nguồn nguyên liệu quan trọng chế tạo que thử phát hiện nhanh SEB phục vụ nhu cầu hiện nay ở trong nước. Xuất phát từ lý do trên, nhóm nghiên cứu do PGS.TS Nghiêm Ngọc Minh, Phòng Hệ gen học Vi sinh, Viện Nghiên cứu Hệ gen, Viện Công nghệ sinh học đứng đầu đã tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu chế tạo que thử phát hiện nhanh độc tố Staphylococcal enterotoxin B (SEB) của tụ cầu vàng” với mục tiêu tạo được kháng nguyên tái tổ hợp SEB đã gây mất độc tính; kiểm tra độc tính của protein SEB đột biến trên động vật thử nghiệm; tạo các dòng tế bào lai sinh kháng thể đơn dòng kháng SEB có độ đặc hiệu cao; xây dựng quy trình tạo các kháng thể (đơn dòng, đa dòng) kháng độc tố SEB; xây dựng quy trình chế tạo que thử phát hiện nhanh, đặc hiệu đối với độc tố SEB trong môi trường và thực phẩm và phân tích, đánh giá độc lập sản phẩm que thử phát hiện nhanh SEB.

Sau một thời triển khai, đề tài đã thu được các kết quả như sau:

- Đề tài đã nhân dòng và xác định trình tự của gen seb tự nhiên của chủng S. aureus được phân lập tại Việt Nam.

- Đoạn gen seb tự nhiên đã được gây đột biến thay thế nucleotide tại 4 vị trí codon 12, 32, 105 và 121; xác định trình tự đoạn gen seb đột biến tại 4 vị trí mã bộ ba biến đổi axit amin Histidine thành Tyrosine.

- Đã biểu hiện và tối ưu các điều kiện biểu hiện protein SEB720 dạng tự nhiên và dạng đột biến với nhiệt độ nuôi cấy là 30oC, nồng độ chất cảm ứng IPTG là 0,5 mM và thời gian cảm ứng là 5 giờ; với protein SEB534 là nhiệt độ nuôi cấy là 37oC, nồng độ chất cảm ứng IPTG là 0,5  mM và thời gian cảm ứng là 5 giờ.

- Đã tinh sạch thành công protein tái tổ hợp SEB biểu hiện từ gen seb720 và seb534 ở dạng tự nhiên và dạng đột biến với nồng độ trung bình của protein mtSEB534 là 1,623mg/ml; wtSEB534 là 1,97 mg/ml; mtSEB720 là 1,452 mg/ml; wtSEB 720 là 1,679 mg/ml.

- Độc tố của protein mtSEB534 và mtSEB720 không gây chết chuột ở mức liều tương đương 10xLD50 (25 g/g) trong khi protein wtSEB534 và wtSEB720 có độc tính cao tương đương nhau gây chết 50% số chuột thí nghiệm (wtSEB534) và 60% số chuột thí nghiệm (wtSEB720) ở liều tiêm 1xLD50 và gây chết 100% số chuột thí nghiệm ở liều 3xLD50 và 10xLD50

- Đã thu được 110,7 mg kháng thể đa dòng từ thỏ, với độ tinh sạch khoảng 98,5%.

- Đã tạo ra được 03 dòng tế bào lai gồm 5A3, 8F11, F6 sản sinh kháng thể đơn dòng kháng SEB và tinh sạch được 102 mg kháng thể đơn dòng kháng đặc hiệu SEB.

- Đã xây dựng được quy trình hoàn thiện để tạo kháng thể đơn dòng kháng đặc hiệu độc tố SEB.

- Đã nghiên cứu chế tạo được que thử phát hiện nhanh độc tố SEB dựa trên kháng thể nhập ngoại để làm cơ sở cho so sánh và kiểm định với que thử sản xuất theo kháng thể sản xuất từ đề tài, đã xây đựng được quy trình chi tiết chế tạo que  thử phát hiện nhanh độc tố SEB.

- Đã nghiên cứu chế tạo được que thử phát hiện nhanh độc tố SEB theo cặp kháng thể của đề tài với ngưỡng phát hiện là 10 ng/ml, độ nhạy là 100%, độ đặc hiệu là 96,66%; que thử phát hiện nhanh độc tố SEB không phản ứng chéo với các độc tố khác như SEA, SEC, SED và SEE nồng độ từ 0-100 ng/ml; thời gian đọc kết quả là 10 phút; đã xây dựng được hướng dẫn sử dụng đầy đủ cho bộ kít phát hiện độc tố SEB.

Như vậy, que thử phát hiện nhanh độc tố SEB của nhóm nghiên cứu đã giúpViệt Nam có thể chủ động trong việc phát hiện nhanh độc tố nhóm B trong thực phẩm, nước... Quan trọng hơn, các que thử này còn giúp chúng ta có thể chủ động trong việc phát hiện độc tố nhóm B do Staphylococcus aureus gây nên. Nhóm nghiên cứu đề tài cũng mong muốn được tiếp tục nghiên cứu hoàn thiện sản phẩm và thử nghiệm ở quy mô rộng hơn que thử phát hiện nhanh độc tố SEB của tụ cầu vàng để có thể thương mại hóa sản phẩm này.

Nguồn: most.gov.vn