Có bao nhiêu dạng plasmid và làm thế nào để nhận biết các dạng này?

Việc hiểu và nhận biết các dạng plasmid trên gel đòi hỏi một sự hiểu biết nhất định về bản chất tự nhiên của ADN. Bài báo dưới đây sẽ tập trung vào bốn loại ADN plasmid phổ biến thường thấy trên gel và cách để nhận biết chúng.

Một phân tử nhưng có nhiều dạng

Khi ADN plasmid được tách và điện di trên gel agarose, bạn có thể quan sát được 2, 3, thậm chí 4 hoặc nhiều băng. Chúng ta đều hy vọng rằng ADN tách được sẽ ở dạng siêu xoắn, nhưng các dạng khác cũng có thể bị lẫn vào. Thứ tự các dạng này xuất hiện trên gel agarose sẽ được chỉ ra trong hình dưới đây (do khác nhau về tốc độ di chuyển trên gel).

Plasmid siêu xoắn

Plasmid siêu xoắn là cấu hình nguyên bản được tìm thấy trong vi khuẩn và xảy ra khi có sự xoắn được tạo bởi cấu trúc xoắn của sợi đôi. Người ta thường so sánh ADN plasmid siêu xoắn giống như các vòng cao su (rubber bands) hay dây xoắn điện thoại (telephone cords). Trong trường hợp tách plasmid, trạng thái xoắn này sẽ không thể giải xoắn nếu các đầu của plasmid được nối với nhau. Plasmid dạng siêu xoắn sẽ di chuyển nhanh hơn trong gel agarose do cấu hình của nó. Trong quá trình tách plasmid, đây là dạng mà người tách mong muốn thu được nhất.

Plasmid dạng vòng, nick

ADN ở dạng siêu xoắn thường không sẵn sàng cho quá trình tái bản. Do đó, trong quá trình sao chép, enzyme topoisomerase của tế bào sẽ tiến hành cắt 1 trong 2 sợi đôi của ADN và tháo xoắn cấu trúc siêu xoắn để polymerase có thể tiến hành sao chép ADN. ADN dạng vòng bị cắt (nicked) sẽ có dạng giống như vòng cao su nhưng không bị xoắn. Dạng vòng lớn này di chuyển chậm nhất trong gel agarose.

Plasmid dạng thẳng

Plasmid dạng thẳng xuất hiện khi có sự cắt trên cả 2 sợi tại cùng một vị trí trên plasmid. ADN plasmid dạng thẳng thường di chuyển nhanh hơn dạng vòng nick nhưng chậm hơn dạng siêu xoắn. Tuy nhiên đôi khi nó di chuyển cùng khoảng cách với dạng vòng nick. Bạn có thể nhận biết dạng thẳng trên gel agarose bằng cách so sánh plasmid chưa cắt với plasmid dạng thẳng đã cắt bởi enzyme giới hạn. Nếu như bạn đang mong muốn thu được dạng siêu xoắn nhưng lại toàn dạng thẳng thì đó có thể là do việc nhiễm nuclease hoặc do bước xử lý quá mạnh trong quá trình tinh sạch.

Plasmid dạng tròn, sợi đơn

Thông thường, trong quá trình tách plasmid bằng ly giải kiềm, plasmid bị biến tính vì liên kết hydro bị phá vỡ do kiềm. Khi đó, dạng tròn vẫn còn nguyên vẹn và quá trình của enzyme topoisomerase sẽ bị hạn chế, còn khi pH trở về trung tính thì liên kết hydro sẽ được hình thành trở lại và dạng siêu xoắn lại xuất hiện. Tuy nhiên, nếu như bước ly giải kiềm này quá mạnh (ví dụ như thời gian ủ quá lâu) thì ADN có thể bị biến tính không thể phục hồi và tạo ra các dạng đóng vòng sợi đơn, dạng này thường di chuyển nhanh nhất so với tất cả các dạng khác trên gel.

Mặc dù có rất nhiều dạng ADN plasmid nhưng chỉ có dạng siêu xoắn sẽ giúp quá trình tách dòng và biến nạp thành công. Do đó, cần biết cách để thu được dạng plasmid siêu xoắn ở hiệu suất cao nhất, bài báo sắp tới của Biomedia sẽ tiếp tục tiết lộ cho các bạn một vài “tip” hữu ích trong quá trình tách plasmid.

Tài liệu tham khảo:

TS. Dr Rebecca Tirabassi, "How to Identify Supercoils, Nicks and Circles in Plasmid Preps",Bitesizebio.

Lược dịch Biomedia Việt Nam